Efecto de un residuo de prolina en la posición dos de la estructura primaria de una actinoporina obtenida de la anémona marina Anthopleura nigrescens (Verril, 1928) - Luna Miranda, Jairo, (J. Luna M., 2019)
Determina el efecto de un residuo de prolina en la posición dos de la estructura primaria de una actinoporina recombinante obtenida de la anémona marina A. nigrescens sobre su actividad lítica mediante técnicas de clonación, expresión, purificación y caracterización funcional de proteínas, para una mejor comprensión de la relación estructura-función de estas moléculas con gran potencial biomédico. No se realiza colecta de individuos de Anthopleura nigrescens ya que se utiliza la información genética generada previamente por Alvarado-Mesén et al., (2019), correspondiente a 5 isoformas de una nueva actinoporina. Para la transformación de células BL21 Star (DE3) por choque térmico el vector NgPro2-pET-21a (+) liofilizado previamente por GenScript es centrifugado a 16000 x g durante 30 s. Posteriormente se le adicionan 20 µL de agua destilada estéril y se le aplica agitación en vortex. Para la expresión de la toxina se utiliza el método de autoinducción desarrollado por Studier, (2005). Para lo cual, primero se preparan y esterilizan durante 20 min a 121°C en autoclave las soluciones 50 XM (65 mM KH2PO4, 117 mM NH4Cl, 12 mM NaSO4, y 62 mM Na2HPO4), 5052 (25% v/v glicerol, 6 mM glucosa y 10 mM lactosa), glucosa 40%, MgSO4 1 M, FeCl3 0.1 M. La purificación de NgPro2 se realiza en un solo paso empleando una columna cromatográfíca de intercambio catiónico CM-Sephadex C25 (Sigma-Aldrich, EUA) (0,8 x 6,0 cm) equilibrada con buffer fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6). Para la comparación de la actividad hemolítica de NgPro2 y Ng se prepara la suspensión de eritrocitos con sangre humana fresca de un donante voluntario aparentemente sano. Los eritrocitos se colectan en presencia de anticoagulante en tubos BD Vacutainer (Becton, EUA), seguidamente se realizan tres lavados con buffer TBS (0.145 M NaCl, 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4) centrifugando a 700 x g durante 5 min a 4 °C.