Aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos en dos especies de vainilla (Vanilla planifolia y Vanilla pompona) - Montero Carmona, Wayner (2009)
Este trabajo evaluó diferentes factores relacionados con el aislamiento, cultivo y fusión de protoplastos de vainilla (Vanilla planífolía G Jackson y Vanilla pompona Schiede) a partir de explantes de hoja (trozos de 0,3 x 0,3 cm) y protocormos {PLBs). Se estandarizó un pretratamiento de tres semanas en oscuridad previo a colocar los explantes en la solución osmótica (0,06 M de ácido 2-N-morfolinetanosulfónico, MES, y 0,4 M de manito!, pH 5,7) por una hora. Posteriormente, se sustituyó dicha solución con una solución enzimática (0,01 M de MES, 0,7 M de manitol, 1% de celulasa, 1% pectoliasa y 0,5% hemicelulasa a pH 5,7) por tres horas a 28 ºC. Ambos procesos se realizaron en oscuridad a 50 rpm. Los protoplastos aislados fueron filtrados (320 mesh), centrifugados y resuspendidos en una solución de sacarosa 0,6 M. Luego se agregó 1 mide solución de lavado (sales MS al 50% con 0,03 M de MES y 0,2 M de manitol a pH 5, 7) para separar por flotación-centrifugación los protoplastos viables. Se realizaron tres lavados (con centrifugaciones a 100 x g durante 5 min). La viabilidad de los protoplastos se evaluó mediante tinción con azul de Evans al 0,01%. Se obtuvieron rendimientos de 2,9x10s ± 0,7x10s protoplastos/g de tejido para explantes de hoja (viabilidad 81%) y de PLBs (viabilidad 80%) de V. p/anífolía. En V. pompona, los rendimientos obtenidos fueron de 2,8x1 as ± 0,8x1 as y 2,5x1 as± 0,8x1 as protoplastos/g de tejido para explantes de hoja (viabilidad 79%) y de PLBs (viabilidad 79%), respectivamente. Para las pruebas de fusión química, la solución de lavado suplementada con 100 mM de Ca 2 + y polietilenglicol (PEG 8 000) al 30% presentó el mayor número de eventos de fusión (eficiencia 15%). Para las pruebas de electrofusión, la solución hipoosmolar (Eppendort®, HA, AL) con los parámetros de fusión O (U1= 7,5 V, 45 s; Un= 170 V, 30 μs - 3; U 2 = 7,5 V, 45 s) mostro...