Evaluación de métodos de concentración y purificación de vesículas extracelulares a partir de muestras de orina - Morales Altamirano, Steven; Arteaga, Griselda B. (Panamá : Universidad, 2019)
Las vesículas extracelulares, son vesículas cubiertas por membrana celular, liberadas al espacio extracelular por todas las células eucariotas, procariotas y vegetales. En el caso de las células eucariotas, éstas liberan diferentes tipos de vesículas extracelulares conocidas como exosomas, producidos por la liberación de endosomas; microvesículas, que se forman a partir de la membrana plasmática; y cuerpos apoptóticos, productos de la muerte celular programada. Los exosomas son catalogados como pequeñas vesículas, cuyo tamaño aproximado es de 30 - 150 nm, y las microvesículas, también conocidas como ectosomas o micropartículas, son vesículas con un intervalo de tamaño muy variable que va desde 50 hasta 1000 nm. Para la búsqueda de genes que sean candidatos a biomarcadores tumorales en cáncer de próstata, es necesario y primordial evaluar métodos que concentren y purifiquen vesículas extracelulares; para luego, por medio de extracción de ARN detectar dichos genes. Estos genes pueden ser encontrados en diferentes células y fluidos. En nuestra investigación se realizó a partir de orina y su precipitado como muestra principal. Para el estudio de vesículas extracelulares, se han desarrollado múltiples técnicas que toman como referencia, las características físicas y químicas de estas vesículas. En esta investigación, se utilizaron la Ultracentrifugación y Ultrafiltración como métodos de obtención y concentración de las vesículas extracelulares, y la Cromatografía de exclusión molecular y Ultracentrifugación con gradiente de densidad de sucrosa como métodos de purificación de las mismas. Las vesículas extracelulares obtenidas mediante las técnicas mencionadas arriba fueron analizadas mediante la técnica de Western Blot utilizando anticuerpos contras las proteínas CD9, CD63 y CD81, las cuales se consideran proteínas marcadoras de exosomas y microvesículas. Los resultados del Western BIot con anti-CD63+Biotina, resultaron cualitativamente aceptables, en comparación con los realizados con los otros dos anticuerpos. La ultrafiltración resultó concentrar de manera óptima las vesículas. Se realizó tinción con Nitrato de Plata a geles donde se hicieron corridas electroforéticas usando los mismos productos anteriores, con el fin de observar una posible disminución de proteínas no vesiculares contaminantes en las fracciones donde, por medio de Western BIot, se detectaron vesículas extracelulares, y se concluyó que solamente la SDG fue capaz de separar las proteínas vesiculares, de aquellas contaminantes presentes también en las muestras.
"Trabajo de graduación para optar por el grado académico de Licenciatura en Tecnología Médica". -- Página de título.
Keywords: VESICULA BILIAR -- AISLAMIENTO Y PURIFICACION -- EVALUACION; WESTERN BLOTTING -- METODOS; ORINA -- ANALISIS; MAPEO DE GENES -- MANUALES DE LABORATORIO; EXOSOMAS; PROTEOMICA -- METODOLOGIA; DIAGNOSTICO DE LABORATORIO; TECNICAS DE LABORATORIO CLINICO; TECNOLOGIA MEDICA -- TESIS Y DISERTACIONES ACADEMICAS