Edición genómica del hongo quítrido de los anfibios Batrachochytrium dendrobatidis utilizando la técnica de CRISPR-Cas9 - Fuentes Campos, Ediner; Querol-Audí, Jordi (Panamá : Universidad, Vicerrectoría de Investigación y Postgrado, 2022)
La quitridiomicosis es una enfermedad de los anfibios causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). Hasta la fecha, ninguna estrategia se ha mostrado eficiente en la lucha contra este patógeno. Por esta razón, en este trabajo se ha diseñado un sistema CRISPR/Cas9 (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas), dirigido a la modificación genética de precisión de los genes oda6 y oda9 de Bd. Estos genes codifican la cadena intermedia I y II del brazo exterior de la dineína flagelar. Por lo que la mutación dirigida, puede permitir la no conformación del flagelo, disminuyendo su motilidad. Los ensayos realizados mostraron que el sistema pre-ensamblado ¨in vitro¨ del sistema de Ribonucleoproteína (RNP), puede ingresar a la zoospora mediante la transfección con electroporación. Además, la proteína verde fluorescente (GFP) pudo ser identificada en las zoosporas electroporadas e incubadas con RNP. Mientras que, no se identificó claramente la fluorescencia en las zoosporas sometidas a incubación con Lipofectamina y RNP. Lamentablemente, fue imposible aislar las cepas posiblemente transfectadas. Sin embargo, es probable, que un número limitado de zoosporas hayan sido transfectadas transitoriamente. A pesar de los múltiples intentos, no se logró identificar los cambios genómicos y esto se puede deber a dos razones. Primero, podría estar relacionada con la efectividad de la transfección debido a que el número de zoosporas modificadas pudo ser reducido, por lo que un cambio funcional como el propuesto puede representar una desventaja que sus pares no transfectadas. Segundo, es probable que la mutación inducida con este sistema haya editado un número limitado de cromosomas en Bd, por lo que el sistema genético pudo reparar las mutaciones inducidas en el gen oda9. Las zoosporas sometidas a electroporación con RNP, mostraron un crecimiento menor que los controles utilizados, lo que podría estar asociados a la posible modificación. La exposición de las Cas9-GFP con las zoosporas tanto controles como tratadas, no mostraron una posible citotoxicidad. El enfoque de estos ensayos sobre el prensamblado del sistema RNP puede ser la dirección correcta para mejorar la herramienta de edición genómica. Palabras claves: Batrachochytrium dendrobatidis, CRISPR/Cas9, RNP, Lipofectamina, anfibios, Panamá
"Tesis presentada como uno de los requisitos para optar al grado de Maestría en Microbiología Ambiental". -- Página de título.
Keywords: GENETICA DE HONGOS -- INVESTIGACIONES; GENOMICA MICROBIANA -- INVESTIGACIONES; HONGOS PATOGENOS -- IDENTIFICACION; ANFIBIOS -- GENOMICA FISIOLOGICA; ANFIBIOS -- ENFERMEDADES; BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS -- IDENTIFICACION; BATRACHOCHYTRIACEAE -- INVESTIGACIONES; GENETICA ANIMAL -- TECNICA; MICROBIOLOGIA -- TECNICA; BIOLOGIA -- TESIS Y DISERTACIONES ACADEMICAS